2.3蛋白質構象穩(wěn)定性的結構分析

圖1不同種類肉肌漿蛋白在不同時間點吸光度及構象速率的變化

對于闡述蛋白質表面疏水性與其乳化活性的關系方面已有大量研究支撐，但是在蛋白質構象特性與乳化活性關系方面卻鮮有研究，這是因為蛋白質的結構會隨著周圍環(huán)境的變化而變化，導致蛋白質構象特性對其油-水界面性質的表征有很大難度。本實驗主要利用鹽酸胍誘導蛋白質變性，從而探究在不同處理時間下蛋白質構象的動態(tài)變化，鹽酸胍的加入能破壞蛋白質的氫鍵、疏水鍵等，進而能破壞蛋白質的高級結構。而蛋白質在油-水界面的構象展開也可以被視為一種類似于部分“變性”的行為，因此鹽酸胍誘導蛋白質結構展開是模擬蛋白質在油-水界面構象變化的良好手段，從而體現(xiàn)在油-水界面上的構象柔順性，以及完成空間定位的難易程度，所以本研究對于揭示不同蛋白乳化特性差異有很重要的作用。

鹽酸胍誘導肌漿蛋白變性的熒光光譜如圖1A～C所示，3種肌漿蛋白都在290 nm波長處達到最大吸光度，由于酪氨酸主要對250～290 nm波長范圍內(nèi)具有吸收。由肌漿蛋白氨基酸組成可知，雞肉肌漿蛋白的酪氨酸含量最高，這也解釋了在第0分鐘時雞肉肌漿蛋白的吸光度相比較而言達到最大。而且豬肉和魚肉肌漿蛋白在第120分鐘時達到最大吸光度，這說明肌漿蛋白三級結構改變時，構象發(fā)生重排且構象展開，而雞肉肌漿蛋白在第120分鐘時吸光度有所下降，說明雞肉肌漿蛋白結構改變較快。由圖1D可知，隨著時間的延長，構象變化速率越來越小，并且在相同時間下，豬肉肌漿蛋白與雞肉肌漿蛋白的峰值變化速率無顯著差異（P＞0.05），而魚肉肌漿蛋白峰值變化速率相比較而言顯著較慢（P＜0.05）。這一結果表明，和魚肉肌漿蛋白相比，豬肉和雞肉的肌漿蛋白構象柔順性更好。

2.4肌漿蛋白界面吸附動力學分析

圖2不同種類肉肌漿蛋白界面壓力與吸附速率的變化

界面流變學提供了流體界面上分子吸附的重要信息。通過測定界面壓力可以表征O/W界面的性質和表面活性物質的吸附和解吸附動力學性質，一般來說，油水界面蛋白質的吸附動力學過程包括以下幾個重要步驟：首先蛋白質在界面上擴散形成一個次級界面區(qū)域；然后到達界面的蛋白質分子部分展開，界面張力下降；最后吸附的蛋白質分子在油-水界面發(fā)生結構重排。

越來越多的研究表明，界面流變性質極大影響著蛋白質的乳化性質，且兩者關系緊密。在利用蛋白質制備乳液的過程中，蛋白質會吸附到油滴表面使得油水界面張力降低，所以張力是影響乳狀液穩(wěn)定性的一個主要因素。乳狀液的形成必然使體系面積大大增加，也就是對體系要做功，從而增加了體系的界面能，這成為體系不穩(wěn)定的來源，因此深入研究蛋白質的油-水界面性質對于揭示分散系的穩(wěn)定機理有重要意義。本研究中，動態(tài)界面張力通過界面壓力隨吸附時間的變化表示，表面張力是由緩沖液的界面張力減去蛋白的界面張力所得。用直線的斜率表示擴散速率，柱狀圖即為吸附動力學特征參數(shù)。

從圖2可以明顯看出，隨著吸附時間的延長，界面壓力增大，表明蛋白質逐漸吸附到油-水界面，并且在最初的5 min內(nèi)3種肌漿蛋白的界面壓力快速增加。其中豬肉肌漿蛋白的界面壓力在初期增長顯著高于其他兩種肌漿蛋白，這一現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于豬肉肌漿蛋白的疏水性高于其他兩者，根據(jù)Li Lingyun等的研究可知表面疏水性是影響蛋白質對界面油側吸附的關鍵因素之一。此后3種肌漿蛋白界面壓力值的增長趨緩，且雞肉肌漿蛋白的界面壓力始終大于其他兩者，而豬肉肌漿蛋白界面壓力最低。當吸附時間達到180 min后，界面壓力趨于穩(wěn)定，表明吸附基本達到平衡。在界面壓力π值增加的起始階段，界面上蛋白質濃度較低，吸附動力學受擴散作用的影響，遵循變形后的Ward和Tordai擴散模型所描述的π隨吸附時間的變化，如下式所示：

式中：C0為初始濃度；K為波茲曼常數(shù)；T為絕對溫度；D為擴散系數(shù)。

由圖2可知，不同種類肌漿蛋白的動力學擴散速率間存在差異性。蛋白質分子在界面上的擴散速率受其粒徑大小的影響，而本實驗結果更能解釋這一現(xiàn)象。在前述理化指標中，粒徑大小為雞肉肌漿蛋白＞豬肉肌漿蛋白＞魚肉肌漿蛋白，而在本部分擴散速率大小為雞肉肌漿蛋白＜豬肉肌漿蛋白＜魚肉肌漿蛋白。這可能是由于大粒徑的肌漿蛋白產(chǎn)生的空間位阻在一定程度上削弱了表面疏水性提高帶來的吸附速率增加。而且魚肉肌漿蛋白的擴散速率較豬肉和雞肉肌漿蛋白間顯著較大（P＜0.05），但雞肉與豬肉肌漿蛋白之間的擴散速率卻無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5肌漿蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性

圖3不同種類肉肌漿蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的差異

在前面的研究中得到，蛋白質的疏水性及粒徑大小等會影響其油-水界面的性質，而蛋白質作為乳化劑其界面特性在它們形成和穩(wěn)定乳液能力方面起著重要作用，進而影響蛋白質的乳化活性。油-水界面屬于高能界面，未加乳化劑形成的乳化體系會很快崩潰，蛋白質是兩性物質，既有疏水基團也有親水基團，這樣才使得蛋白質具有獨特的乳化性能，且蛋白質表面疏水性越大，蛋白質所制得的乳液穩(wěn)定性也會增強。對于不同肉類同種蛋白，表面特性和構象特性的差異會引起乳化活性和乳化穩(wěn)定性的不同，如圖3所示。雞肉肌漿蛋白乳化活性最高，豬肉肌漿蛋白乳化活性稍低于雞肉但無顯著差異性（P＞0.05），但是魚肉肌漿蛋白乳化活性顯著低于豬肉和雞肉肌漿蛋白（P＜0.05），這一結論與蛋白構象穩(wěn)定性結果相符合。在鹽酸胍誘導蛋白變性時，隨時間的增加使其形成剛性結構，這正是導致魚肉肌漿蛋白的峰值變化速率相比較豬肉和雞肉而言差異性顯著且其乳化活性較低的原因。雞肉肌漿蛋白的穩(wěn)定性相對于豬肉肌漿蛋白有所下降但差異性不顯著，可能是因為雞肉肌漿蛋白粒徑相對最大，導致其形成乳液液滴變大，而一般來說乳液液滴越小越穩(wěn)定，所以粒徑可能是導致雞肉肌漿蛋白穩(wěn)定性變差的原因。而3種肌漿蛋白中魚肉肌漿蛋白的乳化穩(wěn)定性顯著最差（P＜0.05），這可能與魚肉肌漿蛋白的構象穩(wěn)定性相對較差有關。

2.6不同種類肉肌漿蛋白各指標的主成分分析

圖4不同種類肉肌漿蛋白主成分分析散點圖（A）和載荷圖（B）

由于測量指標間存在線性相關性，單一的指標不能更清楚地反映出不同種類肉肌漿蛋白間的差異性，因此進一步進行主成分分析。由圖4A可知，第1主成分占59.31%，第2主成分占10.02%，總共占比69.33%，其中樣本F10、F11以及F12對第1主成分貢獻率較大，且與第1主成分呈正相關，而C7樣本對第2主成分貢獻率較大且呈正相關。由圖4B可知，肌漿蛋白的擴散速率、溶解度、乳化活性、乳化穩(wěn)定性、表面疏水性、電位、構象在30 min及60 min時的變化速率對第1主成分貢獻率較大，其中擴散速率和溶解度與第1主成分呈正相關，而除此以外的其他指標與第1主成分呈負相關。而蛋白的構象在90 min以及120 min時的變化速率對第2主成分的貢獻率較大。圖中的乳化活性、表面疏水性、乳化穩(wěn)定性及電位間距離較近，說明這些指標間存在一定的相關性。綜合前述的研究結論可知肌漿蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性與其表面疏水性、電位和構象變化速率有較強的相關性，而擴散速率與溶解度間相關性較強。

3結論

本實驗以豬肉、雞肉及魚肉的肌漿蛋白為研究對象，通過測定其理化性質、氨基酸組成、蛋白質構象、界面性質以及乳化性質進而深入了解其油-水界面的性質。研究結果表明：不同種類肉的肌漿蛋白其理化性質、氨基酸組成、蛋白質構象、界面性質以及乳化性質都有一定的差異性。

肌漿蛋白中氨基酸組成、粒徑和變性溫度等都顯著影響蛋白疏水性，其中雞肉肌漿蛋白中酪氨酸和苯丙氨酸含量較高以致疏水性高于其他兩種肌漿蛋白，而3種肉肌漿蛋白的粒徑間無顯著差異，但豬肉肌漿蛋白與雞肉肌漿蛋白和魚肉肌漿蛋白間有顯著差異。

對于鹽酸胍誘導的蛋白質構象穩(wěn)定性，當肌漿蛋白三級結構改變時，構象發(fā)生重排且構象展開，魚肉肌漿蛋白峰值變化速率相比較而言顯著較慢，說明豬肉與和雞肉的肌漿蛋白結構構象相對于魚肉肌漿蛋白柔順性更強。

肌漿蛋白的吸附動力學實驗表明魚肉肌漿蛋白的擴散速率較豬肉和雞肉肌漿蛋白間顯著較大，這可能是由于大粒徑的肌漿蛋白產(chǎn)生的空間位阻在一定程度上削弱了表面疏水性的提高帶來的吸附速率的增加，但雞肉與豬肉肌漿蛋白之間的擴散速率卻無顯著性差異。

實驗結果還表明，雞肉肌漿蛋白乳化活性最高，魚肉肌漿蛋白乳化活性顯著低于豬肉和雞肉肌漿蛋白，豬肉肌漿蛋白乳化活性稍低于雞肉但無顯著差異性，這可能是由于肌漿蛋白粒徑及構象的不同造成的。但魚肉肌漿蛋白的乳化穩(wěn)定性顯著最差。

本研究以分子間作用力及分子結構分析和界面流變研究作為有力工具，揭示肌漿蛋白納米顆粒的界面吸附動力學規(guī)律。圍繞這個中心可再進行深入研究，例如利用乳液替代食品中飽和脂肪的功能性食品等，利用肌漿蛋白納米顆粒皮克林乳液調控脂肪消化，為功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。